抗菌实验不同操作方法及细节对试验结果的影响

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抗菌实验不同操作方法及细节对试验结果的影响

时间：2015-05-16 20:53:18　来源：　点击量：6678

赵春艳，王 静，冀志江，王晓燕
（中国建筑材料科学研究总院  绿色建筑材料国家重点实验室，北京 100024）

摘要：本文参照ISO 22196-2011《 塑料和其它无孔表面抗菌活度的测量》标准，对硬质非吸水性材料进行抗菌试验，通过比浊法、分光光度计法、经验法确定菌液浓度的大小，分析探讨了接种方法对抗菌实验结果的影响，铺设菌液量的多少及样品培养环境的湿度等实验细节的不同对抗菌结果的差异，为后续抗菌实验提高测试的准确性。
关键字：抗菌实验；菌液量；比浊法；接种方法

随着生活水平的提高和科技的发展，人们对很多材料和制品提出不仅要满足其正常的使用性能，而且要增加如抗菌、净化这样的环境性能，因此具有抗菌功能的陶瓷砖、塑料板、涂料、木地板等各种制品被大量研发应用。国内外也相应推出各类抗菌制品的产品标准或方法标准，目前被广泛应用的标准有《塑料和其它无孔表面抗菌活度的测量》（ISO 22196-2011）、《抗菌涂料》（HG/T3950-2007）、《抗菌针织品》（FZ/T 73023-2006）等。2012年中国抗菌协会依据ISO 22196标准组织了中日抗菌比对实验，中科院理化所、广东微生物研究所、建材纺织行业检测中心及日本抗菌机构等8家实验室参加了此次比对。虽然依据同一标准方法，使用统一的菌种、琼脂、水等实验材料，但实验室间的结果还是有差异的，而且有的偏离较大。抗菌实验结果受多种因素的影响，如实验菌种的活度、营养琼脂等材料的功效、菌液浓度的控制、实验条件的设置、操作细节的差异等。
目前在抗菌实验的具体方法、实验细节对结果影响方面还没有研究报道，本文依据ISO 22196-2011实验方法，以陶瓷为试验样品，通过实验中不同操作细节的比较，分析探讨了抗菌实验不同操作方法及细节对试验结果的影响。

1实验材料及仪器
1.1 菌种
大肠杆菌AS1.90，金黄色葡萄球菌AS1.89（中国科学院微生物研究所菌种保藏中心提供）
1.2实验材料及样品
实验材料：营养琼脂（北京双旋微生物公司提供）、聚乙烯覆盖膜、0.85%生理盐水（自制）、1/500培养液、1/100培养液（自制）；
实验样品：陶瓷砖试片及空白对照样片，5cm×5cm，各50片（福建某厂家提供）

  1.3 试验仪器
超净工作台、紫外-可见分光光度计、高压蒸气灭菌器、恒温恒湿培养箱、旋涡震荡器、冰箱等[1]

2实验方法
整体实验依据ISO 22196-2011《 塑料和其它无孔表面抗菌活度的测量》中的规定。
2.1菌液浓度的确定
2.1.1比浊法
取连传两代的大肠杆菌斜面，用接种环从斜面上刮取1-2环新鲜的细菌，加入培养液，与细菌标准比浊管浓度对比，相同即为108浓度，并依次做10倍递增稀释，从103稀释度中取0.1ml涂布法接种、培养、活菌计数，可计算出初始菌液的浓度C。
2.1.2分光光度计法
将从斜面上刮取的活化的细菌，加入培养液，并进行适当的稀释，取3ml菌液放入比色皿中，在UV2800紫外可见分光光度计中，以1/500的培养液为参比液，波长600nm条件下测试吸光度，得到的吸光度值ABS与比浊法得到的菌液浓度C值进行比较。
2.1.3 经验法
该方法是具有实验经验的操作人员通过目测菌液的浊度，直接取适当量的菌液进行逐级稀释，以活菌计数来判定初始菌液浓度的准确性。
2.2  细菌的接种
细菌的接种方法有很多，如划线法、涂布法、平板倾注法、斜面接种法、液体培养基接种法等，本文对实验室常用的涂布法和平板倾注法进行实验比较。
涂布法是将细菌培养基做成培养基平板，将稀释到一定浓度的菌液滴到平板上，用L涂布棒涂布均匀。将涂抹好的平板平放于工作台面20-30min，使菌液渗透到培养基内，然后放置在37℃的恒温培养箱中培养24h-48h，再进行活菌计数。
平板倾注法是将45-50℃左右的液体培养基倒入装有一定菌液浓度（菌液量一般为1ml)的
平皿中, 37℃的恒温培养箱中培养24h-48h，对菌落数为30-300的培养皿进行菌落计数。

  2.3  样品菌液量的铺设
对硬质非吸水型样品，在表面铺设的菌液量对实验结果会产生影响。本文分别用0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml的大肠杆菌的菌液量铺在抗菌陶瓷试样表面，覆盖上聚乙烯膜，在平皿中放入1ml盐水，以增加单个平皿中的湿度，在37℃、 90%湿度下培养24h，然后用10ml盐水对样品表面进行充分冲洗，用涂布法接种，培养，活菌计数。

3结果与讨论
3.1 菌液浓度确定的几种方法比较
    用分光光度计测得的吸光度值和比浊法、经验法测得的菌液浓度的数值，见表1，几种方法的对应关系见图1和图2.
表1  菌液浓度值与吸光度值的比较

序号	吸光度（ABS值）	比浊法菌液浓度（cfu/ml）	吸光度（ABS值）	经验法菌液浓度（cfu/ml）
1	0.089	7.1×107	0.093	9.5×107
2	0.165	2.7×108	0.308	4.0×108
3	0.14	2.2×108	0.134	1.87×108
4	0.123	1.6×108	0.23	4.35×108
5	0.225	4.1×108	0.361	5.1×108

性能测试涂布法平板倾注法 第1次第2次第3次第1次第2次第3次 空白阴性活菌数,cfu/ml1.88×1052.02×1051.89×1051.13×1051.04×1051.19×105 抗菌样品活菌数,cfu/ml样品A10105001010625 样品B790087509400740077807750 样品C101062101010 抗菌率，%样品A99.9999.9999.7399.9999.9999.47 样品B95.8095.6795.0393.4592.5293.49 样品C99.9999.9999.9799.9999.9999.99 染菌率，%高低   

菌液加量样品D样品E活菌数,cfu/ml抗菌率，%抗菌活性值，R活菌数,cfu/ml抗菌率，%抗菌活性值，R0.2ml099.993.7099.993.70.3ml4.9×10298.801.92.7×10393.841.20.4ml1.0×106006.3×10436.00.190.5ml1.0×106001.0×10600  

从表3的结果看，铺设0.2mL菌液量时，样品D 和E的 抗菌率都是99.99%，但在实验中发现铺上菌液在37℃、 90%RH下作用24h后，样品表面菌液已干，所以实验结果会受到菌液表干、菌自然死亡率高的影响。而铺设0.4ml和0.5ml菌液量后，抑菌率都不好，特别是铺设0.5ml的样品，两个样品抑菌率都是0。实验中还发现，铺设0.5mL菌液时，会有菌液流出样品表面的现象，造成实验误差。其次发现这样多的菌液铺上塑料膜作用24h后，菌液还是有一定的厚度，因为抗菌样品多是依靠菌与样品表面的抗菌物质接触后与细菌起作用的，所以有一部分菌液会接触不到抗菌样品表面，而未被作用，因此抗菌结果受到影响。而铺设0.3ml菌液作用24h后，表面未有表干，抗菌率也都在90%以上。从实验结果看，在硬质非吸水性材料铺设菌液量在0.3ml时最适宜，能够真实反映材料实际抗菌效果。
3.4其他因素
湿度也是影响样品抗菌结果的一个因素。按照标准要求，菌液铺设到样品表面后，放到37℃、 90%湿度中培养24h，恒温恒湿箱的温度控制一般通过加湿器或湿球来达到。该实验中通过加湿器控制湿度在90%左右，但是结果发现，24h后样品表面还是容易表干，因为恒温恒湿机在工作时，会对箱体内部鼓风，只靠加湿器的湿度，远不能满足要求，增加补救措施是必要的，可在仪器内部放置一托盘水，或在平皿底部放置无菌纱布和水，以提高湿度。
材料本身的性能也是影响因素之一。比如有的样品亲水性强，有的样品憎水性强，菌液滴加后，可能会溢出样品表面，这时就要采取一定措施抑制菌液流出。
4总结
影响硬质非吸水性抗菌制品的抗菌性能测试结果的因素很多，如菌的活度、菌液浓度、菌液作用量、实验室温湿度控制、样品本身的性质等等。通过比浊法、分光光度计法、经验法确定菌液浓度，实验发现比浊法测得的菌液浓度值与的吸光度有很好的线性关系，吸光度在0.1-0.2之间时，对应的菌液浓度在（1-4）×108cfu/ml范围，因此可通过测试吸光度值，直接控制菌液浓度高低，提高实验的准确性。细菌常用的接种方法有涂布法和平板倾注法，实验中发现这两种方法得到的结果差异不大，但涂布法染菌率高于平板倾注法。
菌液量过多或过少都会对抗菌结果产生一定的影响，实验发现铺设到硬质非吸水性抗菌制品的菌液量以0.3ml最适宜；控制培养环境的湿度，也很关键；各实验室检测条件、检测人员、检测设备、实验方法的不同，也都会造成实验结果的差异。总之影响抗菌实验结果的因素很多，只有通过不断的、细致的实验来提高抗菌测试的准确性。

  参考文献
[1]. 朱艳静,李宇. 测试菌体浓度的简便方法[D].工业微生物, 2006.12
[2]. 王志义.抗菌陶瓷研究现状及发展趋势[D].中国陶瓷工业，2006.6
[3]. 刘晓蓉主编.微生物学基础[M].中国轻工业出版社，2011.8
[4]. 杜连祥等. 工业微生物学实验技术[M].天津科学技术出版社,1992.

资助项目：国家十二五科技支撑计划课题(2012BAJ02B08) (2012BAB18B04-2-1) (2012BAJ20B02-05)
作者简介：赵春艳（1982-），女，E-mail:chunyanzhao1234@126.com

网址：抗菌实验不同操作方法及细节对试验结果的影响 https://www.yuejiaxmz.com/news/view/1461515

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