脑声常谈丨小鼠昼夜节律变化的检测

夏末秋初，调整作息适应昼夜变化 #生活知识# #日常生活# #季节变换指南#

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哺乳动物的昼夜节律系统受生物钟调控，生物钟是由核心生物钟基因构成的转录翻译反馈环。小鼠体内几乎每一个细胞内都存在生物钟，实现昼夜节律的调控。生物钟基因缺失或突变能够导致小鼠生物钟的紊乱，行为学上可以观察到内在节律丧失、周期偏离正常范围，而这些突变小鼠分别有睡眠、代谢、生殖、肿瘤等不同的表型，提示了生物钟基因或生物节律的改变与疾病有密切的关联。

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由于光线是昼夜节律系统中最有力的授时因子，光照对昼夜节律系统的同步是普遍存在的现象。对于小鼠来说，光照是影响昼夜节律变化的最重要环境因素，可以重置小鼠的昼夜节律，通过牵引作用实现小鼠昼夜节律与外界环境同步。在现实生活中，跨时区飞行、季节性日照时间的改变，都是外界光照对机体昼夜节律牵引的现象。许多基因突变小鼠都表现出适应外界光照变化能力的改变。光线还可以直接对小鼠的活动起到抑制作用(masking)。机体对光照的响应很大程度上依赖昼夜节律系统，因此人们通常可以利用不同的光照周期、光照时间点、光照强度来检测小鼠昼夜节律系统对于光线的响应，记录小鼠的行为变化，进而分析某些基因的缺陷是否对生物节律产生影响。

以Slc7a11tm1a/tm1a突变小鼠为例，使用不同的昼夜节律行为学检测方法对小鼠进行行为学表型检测，包括代谢笼、小鼠自由跑轮活动监测、倒时差反应、长光照、骨骼光周期和T7-cycle等。这些实验方法可以作为昼夜节律表型分析的筛选流程。

小鼠昼夜节律检测方法

代谢笼检测小鼠昼夜节律

代谢笼由检测活动、食物、水、氧气含量和二氧化碳含量等检测模块和数据记录、数据储存等模块组成的一套实验动物监测系统。该系统可以连续实时记录小鼠活动、进食、饮水、氧耗量和二氧化碳产生量。以Slc7a11tm1a/tm1a突变小鼠和野生型小鼠为例，用代谢笼检测小鼠活动和饮食昼夜节律过程的具体操作如下：将小鼠单独放置于代谢笼的笼盒内，前3d为适应阶段，从第4d开始记录，第4d至第6d每隔20min记录小鼠活动、饮食和饮水数据，连续记录3d。适应阶段以及记录阶段小鼠所处环境皆为正常饲养环境，光照周期为标准光照周期(8:00开灯，20:00关灯)。

跑轮检测小鼠内在昼夜节律周期

小鼠跑轮活动由生物节律监测系统记录，与代谢笼相比，跑轮记录是检测小鼠活动昼夜节律的经典设备，可以长期检测小鼠活动的节律，被广泛运用于异常小鼠昼夜节律的筛选，发现了一系列昼夜节律异常的突变体。实验过程中，将小鼠单独放置于带有滚轮的笼盒中，在笼盒中小鼠自由获得食物和饮水。笼盒与记录仓相连，每个记录仓可以单独调节光照周期以及光照强度。小鼠在滚轮上每跑动一圈，记录仓便记录一次数据。

跑轮检测小鼠内在昼夜节律周期的具体操作过程如下：将小鼠单独放置于带有滚轮的笼盒中并置于记录仓中与记录系统连接。小鼠在标准光照环境中(8:00开灯，20:00关灯)牵引7~10d，使得每一只小鼠的昼夜节律被外界光照稳定牵引。接下来关闭灯光，环境灯光变为持续黑暗，并至少记录14d。因为外界环境恒定，不存在影响小鼠内在昼夜节律的外界因素，所以持续黑暗中小鼠跑轮结果反映了小鼠内在的节律(free running)。随后根据跑轮记录到的小鼠在持续黑暗下活动可以计算得到小鼠的内在节律周期。周期可以根据在持续黑暗中小鼠跑轮活动的斜率计算得到，公式如下：

tau=24-Δt/n(h)

其中tau代表周期；Δt表示活动起跳点迁移的时间，前移为正，后移为负；n表示持续黑暗中的天数；公式中Δt/n就是两者的比值，也就是小鼠跑轮起跳点的斜率，表示在n天的持续黑暗中，平均每天活动起跳点迁移的小时数。因此，持续黑暗中小鼠昼夜节律的周期反映了小鼠内在生物钟的快慢。

倒时差实验

为检测小鼠适应外界环境昼夜变化的能力，通常使用倒时差实验来检测小鼠被重新牵引的能力。倒时差实验具体操作步骤为：将小鼠单独放置于带有滚轮的笼盒中并置于记录仓中与记录系统连接，首先小鼠被置于标准光照环境中(8:00开灯，20:00关灯)7~10d，使得小鼠昼夜节律被稳定牵引；随后将开灯时间周期前移，如：2:00开灯，14:00关灯，模拟向东跨6个时区飞行。小鼠倒时差后驯化天数是视小鼠适应时差的天数而定(在完全适应新灯光后再驯化固定天数)。在小鼠跑轮活动被稳定牵引后，再将开灯时间后移，如：8:00开灯，20:00关灯，模拟向西跨6个时区飞行。分别测量小鼠在2次倒时差过程中的起跳点时间的变化，来说明小鼠适应新时区的快慢，反应小鼠被再次牵引的能力(图1C)。随后根据小鼠完全适应新时区所需要的天数来反应适应环境变化的能力。

Fig1小鼠昼夜节律检测方法光照方案示意图

当昼夜节律出现缺陷的时候，小鼠的活动和饮食规律有可能出现昼夜紊乱，而代谢笼具有实时记录活动及摄食的功能。

小鼠遗传背景对倒时差的影响

小鼠的遗传背景对小鼠的许多表型有影响，即使相同的C57BL/6分出的亚系C57BL/6J与C57BL/6N在一些表型上也存在差异。在进行时差反应实验时，需要非常关注小鼠的来源。此外，昼夜节律对外界信号的响应程度也取决于外界信号的高低和内在昼夜节律的强弱，由两者相对大小决定。PS50(适应一半时差所需要的时间)的差异情况和小鼠适应时差的过程，以及调时差过程中活动起跳点时间的变化趋势一致这些结果说明，不同遗传背景的小鼠及不同厂商的小鼠适应时差的能力不同。因此在选择时差反应实验时，需要严格控制遗传背景，不能使用不同来源厂商供应的小鼠之间进行比较。

往期推荐

文献引用： 1.Circadian rhythm as a therapeutic target[J]. Ruan Wei;Yuan Xiaoyi;Eltzschig Holger K..Nature Reviews Drug Discovery,20212.Circadian Pattern of Acute Myocardial Infarction and Atrial Fibrillation in a Mediterranean Country: A study in Diabetic Patients[J]. Daios Stylianos;Savopoulos Christos;Kanellos Ilias;Goudis Christos Argyrios;Nakou Ifigeneia;Petalloti Stergiani;Hadjidimitriou Nicolas;Pilalas Dimitrios;Ziakas Antonios;Kaiafa Georgia.Medicina,20213.Light Input to the Mammalian Circadian Clock.[J]. Dannerfjord Adam A;Brown Laurence A;Foster Russell G;Peirson Stuart N.Methods in molecular biology (Clifton, N.J.),20214.The Concept of Coupling in the Mammalian Circadian Clock Network[J]. Violetta Pilorz;;Mariana Astiz;;Keno Ole Heinen;;Oliver Rawashdeh;;Henrik Oster.Journal of Molecular Biology,20205.曾义准,张陶,徐璎.分析小鼠昼夜节律变化的行为学方法[J].遗传,2022,44(04):346-360.6.哺乳动物生物钟的遗传和表观遗传研究进展[J]. 岳敏;杨禹;郭改丽;秦曦明.遗传,2017(12)

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